生物樣品掃描電鏡制樣技術(shù)
無論是透射電鏡或是掃描電鏡,，樣品均處于電鏡鏡筒的真空之中,。而大多數(shù)的生物樣品都是柔軟而且含大量水分的,。因此，也和透射電鏡的樣品一樣,，在進(jìn)行掃描電鏡觀察前,，必須對生物樣品作相應(yīng)的處理。 掃描電鏡的功能很多,，不同的功能對樣品的要求不同,。例如二次電子像與背散射電子像和吸收電子像對樣品的要求基本相同，而與X射線微區(qū)分析對樣品的要求相差較遠(yuǎn),。我們首先介紹二次電子像的生物樣品制備技術(shù),。此外，由于樣品的性質(zhì)不同,，其處理方法和程序也有不同,。主要分兩大類，一類為含水量少的硬組織,，如毛發(fā),、牙齒及植物的花粉、孢子,、種子等,。此類樣品一般含硅質(zhì)、鈣質(zhì),，角質(zhì),，砝瑯質(zhì)和纖維素等成份，所以通常只經(jīng)過表面清潔,、裝臺(粘膠),、導(dǎo)電處理等簡單過程即可進(jìn)行觀察。如要觀察其斷面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)時,，經(jīng)斷裂,、解剖或酶消化、蝕刻等再裝臺,、鍍膜處理,，即可進(jìn)行觀察拍照。另-類為含水分較多的軟組織,，如大多數(shù)的動植物器官,、組織及細(xì)菌等均屬此類。對于此類樣品,，在金屬鍍膜前,，一般都需經(jīng)過固定、脫水,、干燥等處理,，如不經(jīng)處理或處理不當(dāng)，就會造成樣品損傷和變形,，出現(xiàn)各種假像,，因此對每一處理步驟都應(yīng)給予重視。 但是,，不管是那一類樣品的制備,，都應(yīng)達(dá)到以下要求： 盡可能保持樣品活體時的形貌和結(jié)構(gòu)，以便如實(shí)地反映樣品本來面目,。 在樣品的干燥過程盡可能減少樣品變形,。 樣品表面應(yīng)有良好導(dǎo)電性能和二次電子發(fā)射率，以防止和減少樣品的荷電效應(yīng),。 樣品的前期處理 掃描電鏡樣品的前期處理主要包括表面清潔,、固定、漂洗和脫水等過程,。而每一過程的處理方法基本上都是沿用透射電鏡樣品的處理方法的,，所以,，這里不一一再作詳述。但是,，由于兩種電鏡觀察的要求不同,，因此，在處理中也有不同之處： 1.透射電鏡主要研究樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)要求內(nèi)部結(jié)構(gòu)保存好,，因而樣品宜盡可能小使固定液能迅時滲入固定,。掃描電鏡觀察表面形貌，而且為了操作方便選取較大樣品,。一般在8～10mm2左右,，高度可達(dá)5mm。 2. 掃描電鏡要求完整且清潔表面,，但是在許多樣品的表面常附有粘液,、血液、組織液及灰塵等雜物,，妨礙著觀察,，以致造成對圖像的錯誤解釋，所以,，在固定前都必須特別做好表面的清潔工作,。 以下簡介前期處理方法： 清潔'：對樣品的清潔可根據(jù)不同的樣品采用不同的方法，其中常用的方法有: 表面正常干燥的樣品如葉,、花瓣,、莖等蠟葉標(biāo)本，可用吹氣球或用除塵器吹凈,，也可用軟毛筆輕掃等方法除去表面的灰塵和其它雜物,，但需注意不要損傷樣品，吹風(fēng)和清掃的力量取決于樣品的硬度和污染的程度,。 一般動植物組織,，可用蒸餾水、生理鹽水或緩沖液漂洗或沖洗,。至于采用何種清潔液清洗,，要視組織本身對清洗液滲透壓變化的敏感程度而定，如用緩沖液清洗時,，應(yīng)與配制固定液的緩沖液一致,，否則會因性質(zhì)不同而產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)從而影響固定效果。 對有油脂分泌物和蠟質(zhì)覆蓋層的樣品如毛發(fā),、蚧蟲等,，應(yīng)采用有機(jī)溶劑反復(fù)浸洗。 對一些附有粘液的組織可采用酶解法或其它試劑處理來清洗,，如一般組織可用木瓜蛋白酶和淀粉酶清洗,；腸粘膜可用糜蛋白酶清洗,；用胰蛋白酶可分離和清洗胃粘膜的細(xì)胞。有些組織也可用試劑進(jìn)行清洗,，如要分離神經(jīng)細(xì)胞可用稀釋的乙二胺四醋酸處理,，用甘油和稀釋的乙醇延長浸漬時間可以從分泌乳腺中除去乳汁等。 對微小的樣品要用離心法或放在用鎳過濾網(wǎng)制的小容器中清洗,。 對于特殊的樣品還須用特殊的方法進(jìn)行清洗,。 固定: 樣品的固定,、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同,，但由于掃描電鏡觀察的是樣品的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌,，因此,，在固定、漂洗和脫水過程也與透射電鏡樣品處理有不同之處,。 除采用戊二醛,、四氧化鋨、高錳酸鉀等固定液進(jìn)行固定外,，還可采用下列幾種固定液： Sjodstrand固定液： A液：氯化鈉40.3g+氯化鉀2.1g+鈣0.9g+雙蒸鎦水500ml B液：醋酸鈉9.714g+凡羅那鈉(Veronal)14.74g+雙蒸餾水500m1 使用時吸取A液10ml,，B液3.4ml，再加0/1mol/L鹽酸11ml和鋨酸05g+50ml蒸餾水 Dalton氏固定液： 此種固定液為4％重鉻酸鉀(pH7.2)與3.4％氯化鈉等量混和后,，再與2％四氧化鋨等量混使即得,。 這種固定液無沉渣，對樣品損傷少,。 在能保持樣品不變形的前提下,，不少樣品(特別是植物樣品)采用戊二醛單固定即可。 為了加強(qiáng)固定效果,，還可將幾種不同的固定液配合使用,，進(jìn)行雙固定或多次固定(尤其是動物樣品)；如用用戊二醛作前固定,，用鋨酸作后固定,。 脫水：脫水劑常用乙醇和丙酮。丙酮能使組織塊變硬,，是它的優(yōu)點(diǎn),。 樣品的干燥 生物樣品的制備中，干燥是最關(guān)鍵的步驟,。干燥過程除引起樣品收縮之外,，水的表面張力會使樣品表面形貌發(fā)生很大的變化，這對掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害,。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水,，是為了包埋劑的滲透(因水不與包埋劑互溶,，而乙醇則能互溶)。而在掃描電鏡的樣品制備中,，脫水是用表面張力小的乙醇取代表面張力很大的水,，從而使干燥過程對樣品表面產(chǎn)生的影響較少。然后就是如何設(shè)法使樣品表面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇,，這就是干燥,。目前常用的干燥方法主要有空氣干燥法、臨界點(diǎn)干燥法,、冰凍干燥法,、真空干燥法和莰烯干燥法等。 空氣干燥法 空氣干燥法又稱自然干燥法,，就是將經(jīng)過脫水的樣品,，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。此法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡單易行和節(jié)省時間,，它的致命缺點(diǎn)是在干燥過程中,，組織會因脫水劑揮發(fā)時表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此,，此種方法一般只適用于外殼(表面)較為堅硬的樣品,。 在采用空氣干燥時，為了減少樣品的收縮變形,，除使用易揮發(fā)和表面張力小的脫水劑如乙醇,、丙酮等外，還應(yīng)使樣品得到充分固定,，特別是須經(jīng)四氧化鋨固定效果才較好,。因?yàn)樗鼤菇M織變得較為堅硬，使收縮變形減少,。 然而,，空氣干燥引起的收縮并非完全不利，有時可以通過收縮使細(xì)胞之間相互剝離,，從而能清楚地觀察到一個個單獨(dú)存在的細(xì)胞及其表面結(jié)構(gòu),。此外，還可通過細(xì)胞成份在干燥時的收縮,，觀察到細(xì)胞內(nèi)的線粒體,、細(xì)胞核等成份的存在。但這種機(jī)會很少,，而且因收縮帶來的不利是主要的,，所以，目前很少采用,。 臨界點(diǎn)干燥法 臨界點(diǎn)干燥法是一種消除了物相界面(液相／氣相),，也就是消除了表面張力來源的干燥方法,。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷,，此法所用的儀器結(jié)構(gòu)不甚復(fù)雜,，操作較為方便，所用的時間也不算長,，一般約2h左右即可完成,，所以，是最為常用的方法,。 物質(zhì)的臨界點(diǎn)是1822年由Charles cagridde La Tour發(fā)現(xiàn)的,。他將不同的液體分別裝進(jìn)玻璃試管并密封起來，然后一邊轉(zhuǎn)動一邊加熱,，這時,，他發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高,，試管內(nèi)的液相和氣相之間的彎月面開始變得模糊起來,，只有在試管冷卻之后，彎月面才又重新出現(xiàn),。每種液體都存在某一溫度,，在這一溫度時，液相的彎月面完全消失,。 那么,，彎月面的消失意味著什么呢?它意味著液相和氣相之間的界面沒有了，之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象,，是因?yàn)樵诿芊獾娜萜骼?，液體受熱膨脹，而氣體本身被壓縮,，最后在某一特定的溫度和壓力下,，液體由于膨脹，氣體由于被壓縮而使兩者的密度相同,，因而相互混合成一種均一的流體,，原先存在它們之間的彎月面(即液面)就消失了，表面張力也自然消失了,。因此,，所謂臨界點(diǎn)，就是指使物質(zhì)的氣態(tài)和液態(tài)兩相之間達(dá)到相同密度,，成為均一流體狀態(tài)時的溫度和壓力的總稱,。此時的溫度稱臨界溫度；此時的壓力稱臨界壓力,。 不同的物質(zhì)都有其特定的臨界點(diǎn),，一般用于掃描電鏡樣品臨界點(diǎn)干燥的置換劑的臨界溫度和壓力見表10-1,。如果在臨介點(diǎn)進(jìn)行干燥，由于表面張力消失就不會造成樣品表面的損傷,。但進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥,，需用專用的臨界點(diǎn)干燥器。具體處理步驟如下： 1.固定脫水 按透射電鏡常規(guī)制樣方法進(jìn)行,。 2.純丙酮置換乙醇 如樣品是用乙醇脫水的,，在脫水至100％后，用純丙酮置換15～20min,。 3.中間液處理 即在用丙酮置換乙醇后,用醋酸異戊酯(乙酸異戊B8)處理15-80min(也可以過夜)置換丙酶,。由于醋酸異戊酯與液態(tài)二氧化碳能互溶，使液態(tài)二氧化碳容易滲入樣品中,。 4. 裝樣 將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中,，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內(nèi),，蓋上蓋并擰緊以防漏氣,。(注：在裝樣前，應(yīng)先打開儀器電源,，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0℃處預(yù)冷10～15min,，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進(jìn)入樣品杯中)。 5. 注入液體二氧化碳 依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進(jìn)氣閥在0～10℃下,，向樣品杯注入液體二氧化碳,。 6. 漂洗 當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的50％(通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度)時,，關(guān)閉儀器進(jìn)氣閥,，靜置15～20min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散,，然后,，打開儀器排氣流量計閥門和進(jìn)氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右,，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳)再關(guān)閉排氣閥,；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的80％左右，關(guān)閉進(jìn)液閥,，停止充液,。 7. 加溫置換 將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20℃處經(jīng)15～20min后，由于溫度升高,，杯內(nèi)液體二氧化碳逐漸氣化,，因此，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置換,。 8.氣化 將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上(35～40℃),，此時隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸增加,，達(dá)到二氧化碳的臨介點(diǎn),，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)到7134Pa時,，經(jīng)5min后,，即可排氣。 9. 排氣 在保持溫度不變的條件下(即不關(guān)電源),，打開流量計的排氣閥門,，以1.0～1.51／min的速度排氣(速度慢些更好)。約經(jīng)45～60min后,，排氣完畢,，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調(diào)節(jié)至室溫約5rain后,，即可取出樣品裝臺鍍膜(若不能立即裝臺,，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存)。 臨界點(diǎn)干燥的成敗如何,；與每一步的操作有很大關(guān)系,，因此,，操作時應(yīng)注意以下事項(xiàng)： 1.在樣品放進(jìn)樣品杯前,，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至0～10℃，因?yàn)闇囟冗^高,，充入的液體二氧化碳會立即氣化膨脹,，壓力增加，妨礙二氧化碳液體繼續(xù)進(jìn)入樣品杯,。 2.樣品不宜過濕,，但也不能讓其表面干涸，應(yīng)在半干半濕時送入樣品杯,。因?yàn)檫^濕表明乙酸異戊脂太多會干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂,，影響干燥效果。而過干又會因空氣干燥而造成樣品己變形,，再進(jìn)行臨介點(diǎn)干燥也沒有意義了,。 3.一次加入的樣品不宜過多，以免帶進(jìn)過多的中間液,，使樣品干燥不完全,，另外，樣品過多使二氧化碳量充入不足而達(dá)不到臨界點(diǎn),。 4.充入液體二氧化碳的量要足,。因?yàn)槌湟毫坎蛔?，達(dá)不到臨界值，起不到臨界點(diǎn)干燥作用,，一般充液量應(yīng)達(dá)樣品杯容積的2/3左右,。 5.在加溫氣化時，實(shí)際操作溫度應(yīng)超過臨界值,，以保證達(dá)到充分的臨界狀態(tài),。 6."開"、"閉"閥門時,，動作要輕緩,，盡量防止二氧化碳液對樣品產(chǎn)生突然沖擊而造成樣品損傷。因此,，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或?yàn)V紙,。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢，一般放氣時間應(yīng)在．4Omin以上,，有時也可以放氣過夜或過中午,。 二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除用液體二氧化碳外，也有用固體二氧化碳(干冰)作干燥介質(zhì)的,。與液體二氧化碳比較,，固體二氧化碳有以下優(yōu)點(diǎn): 1.有利于微小樣品的干燥，例如像玻璃片上的游離細(xì)胞,，若用液體二氧化碳干燥,，由于二氧化碳?xì)怏w急劇地噴入樣品杯內(nèi)很可能使樣品被吹掉，而用固體二氧化碳干燥,，則完全沒有這種危險,。 2.不需要用鋼瓶，鋼瓶很重,，搬運(yùn)麻煩,；用固體二氧化碳時,，有適當(dāng)大小的保溫瓶(如冰壺)就可以了，因此很方便。 3. 能保證二氧化碳裝滿樣品室,，即使用固體二氧化碳時,，每次都能準(zhǔn)確地放入足夠酌量,，而不會像使用液體二氧化碳時由于鋼瓶中二氧化碳不足,，充不進(jìn)樣品杯內(nèi)，使樣品干燥不完全而造成損傷,。 4.夏天使用方便 在使用液體二氧化碳時,，若室溫超過臨界溫度，液體二氧化碳難以從鋼瓶進(jìn)入樣品室，而固體二氧化碳則不受室溫高低的影響,，即無論多熱的天氣也能放進(jìn)足夠量,。 5.不污染樣品 使用液體時，往往由于鋼瓶內(nèi)有鐵銹粉末充進(jìn)樣品杯而污染樣品,，而固體二氧化碳則無此種污染,。 固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除使用專門裝置外，也可用任何一種液體臨界點(diǎn)干燥器,，不過由于液體臨界點(diǎn)干燥器的樣品室較小,，操作起來不大方便。固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法的樣品處理{固定,、脫水等)與液體二氧化碳臨界干燥法相同,，所不同的是在于干燥時的具體操作。其操作步驟是：先將干冰用加熱器切成樣品杯容積大小的圓柱體(也可敲成碎塊或粉末),，放于樣品籠的頂部,，蓋好樣品杯蓋，然后加熱到15℃,，使干冰熔化成液體二氧化碳,，這時干燥器內(nèi)的壓力上升，再加熱到40C,，使液體二氧化碳逐漸氣化,，壓力繼續(xù)上升達(dá)到臨界值，幾分鐘后即可排氣(溫度不變),。當(dāng)氣體全部排出,，壓力回到零后，即取出樣品,，裝臺鍍膜觀察,。 冰凍干燥法 冰凍干燥是將經(jīng)冰凍的樣品置于高真空中通過升華，除去樣品中的水分或脫水劑的過程,。冰凍干燥的基礎(chǔ)是冰(或固態(tài)溶劑)從樣品中升華，也就是使水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài),，不經(jīng)過中間的液態(tài),不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用,，因此，能較好地避免或減少了在干燥過程中對樣品的損傷,。冰凍干燥方法有兩種,，即含水樣品直接冰凍干燥和樣品脫水后從有機(jī)溶劑中冰凍干燥。 含水樣品直接冰凍干燥法: 此法相對于臨界點(diǎn)干燥有其明顯優(yōu)點(diǎn),，即能直接使含水樣品冰凍干燥,，不需要用有機(jī)溶劑脫水和置換，避免了無極性溶劑對樣品成份的抽提作用，因此,，不會使樣品收縮和膜結(jié)構(gòu)或表面物質(zhì)產(chǎn)生穿蝕,。如用此法干燥植物葉的樣品，葉面角質(zhì)層能保持自然狀態(tài),，從而得到好的實(shí)驗(yàn)樣品,。 含水樣品冰凍干燥的步驟如下： 1.取材固定，按常規(guī)方法進(jìn)行,。 2.冰凍保護(hù)劑滲透 將樣品置于10％～20％的二甲基亞砜(DWSO)水溶液或15％～40％的甘油水溶液,，或氯仿中浸泡數(shù)小時。 3.驟冷 將經(jīng)保護(hù)劑處理過的樣品迅速投入到用液氮預(yù)冷到一150℃的氟利昂12或氟利昂22冷凍劑中,，使樣品中的水分在片刻間凍結(jié),。 4.升華干燥 將已驟冷凍結(jié)的樣品移到冰凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣臺上(保持一70C以下),抽真空(真空度為10～10-1Pa)，經(jīng)幾小時或數(shù)天后,，樣品即達(dá)到干燥,； 5.裝臺鍍膜 先將冰凍干燥器的樣品臺加熱至室溫，然后將干燥器放氣,，取出樣品迅速裝臺粘樣,，送入鍍膜儀中鍍膜。 但是這種方法也有其不足之處,，就是干燥時間太長,，如單層細(xì)胞也要幾小時才能達(dá)到干燥，而幾毫米厚的組織塊可能要持續(xù)干燥一至數(shù)天,，同時要判斷是否干燥也較為困難,，冰凍過程中會形成冰晶，使細(xì)胞成份因受冰晶擠壓而產(chǎn)生移位和變形,，造成人為的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),。因此必須采取一些防止這一不良情況產(chǎn)生的措施，以使樣品的損傷減少到可以忽略的程度,。 為了防止冰晶的形成,，可采用以下辦法：①用驟冷劑提高冰凍速度。常用的驟冷劑有氟利昂12和氟利昂22,；此外,，液態(tài)一固態(tài)氮的半凝固狀混合物的溫度可低至-210℃，因此可作為驟冷劑,；②用冷凍保護(hù)劑如二甲基亞砜,、甘油、明膠或氯仿處理樣品,，能抑制水分子集合成冰晶和限制冰晶的大小,，以保護(hù)樣品免受冰晶的損傷,，尤其以氯仿處理的效果為好，因?yàn)槁确乱子趽]發(fā),，不留在樣品表面而影響觀察,。此外，透射電鏡冰凍制樣技術(shù)中的冷凍方法,，也適用于掃描電鏡,。 樣品脫水后的冰凍干燥: 這種方法是用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機(jī)溶劑如乙醚、氯仿,、氟利昂113等中,，然后連同這些溶劑一起冰凍并在真空中升華(直接用于脫水的乙醇作為冰凍干燥劑也有效)而達(dá)到樣品干燥的；這種方法相對于前一種方法有下列優(yōu)點(diǎn),；即有機(jī)溶劑在冰凍時形成非晶體固態(tài),，不像水那樣結(jié)冰時膨脹，因此不會產(chǎn)生冰晶對樣品的損傷,。有機(jī)溶劑能以比水快得多的速度從固態(tài)中升華,，因此，干燥時間比上一方法短得多,，不需要專用的冰凍干燥裝置,，只用普通的真空干燥器加一塊金屬塊作樣品臺即可。但此法也有不足之處,，就是有機(jī)溶劑對樣品成份有抽提作用,，易造成部分內(nèi)含物丟失。 此法的操作程序與前法基本相同,，只是無需用冷凍保護(hù)劑處理而已?，F(xiàn)將幾種方法介紹如下： 氟利昂TF冷凍干燥法： 1. 固定脫水按常規(guī)方法進(jìn)行。 2. 置換 按圖中所示的比例配好氟利昂TF和酒精混合液,，并通過這些混合液將樣品逐步引入100％氟利昂TF,。 3. 冷凍 把樣品浸入液氮中冷凍。 4.干燥 將樣品放在預(yù)先冷卻的鋁座上,，再移入真空噴鍍儀中抽真空(約1Pa),，經(jīng)0～20min后即完全干燥。90min后鋁座變?yōu)槭覝?，即取出樣品,、裝臺、鍍膜觀察,。 乙腈(acetonitrile)真空干燥法： 這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時會冷卻固化這一性質(zhì)，將樣品干燥的很獨(dú)特的方法,。其操作步驟如下： 1. 固定,、水洗按常規(guī)方法進(jìn)行,。 2. 脫水 使用上升的系列乙腈(50％～100％)脫水各20min。 3. 滲透 在容量約Iml的鋁制容器中裝滿乙腈,，并投入樣品,。 4. 升華 把容器放入真空噴鍍儀中抽真空，此時由于乙腈急速蒸發(fā)而使容器急劇冷卻,，其中乙腈也變成冰狀固體,。然后繼續(xù)抽真空，使乙腈升華,，約經(jīng)30min,，樣品即達(dá)干燥。 5. 待容器回升到室溫后,，即可取出樣品裝臺鍍膜進(jìn)行觀察,。 據(jù)田中敬一報道此法干燥的效果與臨界點(diǎn)干燥沒有什么不同。 茨烯干燥法 莰烯是一種樟腦類無色結(jié)晶體,，能溶于醚,、環(huán)乙烷、環(huán)己烯和氯仿中,，室溫下呈固體狀,，能在較低的溫度下升華，從固態(tài)直接變成氣態(tài),，表面張力小,，故經(jīng)它干燥的樣品較松軟，變形小,，操作也較簡便,。 莰烯干燥法是由Warrens．Buk于1971年提出的，其操作步驟如下： 1.取新鮮材料迅速投入0．1mol/L磷酸緩沖液中漂洗,，然后投入5％的戊二醛(用磷酸緩沖液配制的pH7.4)中固定1h,。 2.轉(zhuǎn)至加有5.4％蔗糖的0．1mol/L磷酸緩沖液中，在冷凍溫度下過夜,。 3.用l％的四氧化鋨(磷酸緩沖液配制)溶液中固定2h,。 4.用磷酸緩沖液或雙蒸水漂洗2～3次，每次,、15min,。 5.用30％，50％,，70％,，90％，95％和100％丙酮脫水,，每級15min,。 6.用100％的苯脫酯,。 7.在1：1苯與環(huán)氧丙烷中浸泡15min，再轉(zhuǎn)至純環(huán)氧丙烷中,，在45℃下經(jīng)20min后,，轉(zhuǎn)入預(yù)先在水浴箱中加溫成液體的莰烯中浸透，取出樣品裝臺,。 8.放入真空干燥器中,，在室溫下抽真空1h左右，使莰烯直接從固體中升華,，然后鍍膜,。 樣品的裝臺粘膠 將樣品裝固在樣品臺上，最好采用導(dǎo)電膠,。常用的導(dǎo)電膠有兩種：一種是銀粉導(dǎo)電膠,，這是一種將很細(xì)的銀粉拌在低電阻樹脂液內(nèi)制成的膠水，使用較為方便,，這種樹脂的絕緣電阻低,，干后的電阻率僅為0.02Ω／mm，并可以被溶劑溶解還原,也有其它產(chǎn)品的銀粉導(dǎo)電膠,。另一種是將石墨粉拌在低電阻樹脂液內(nèi)的碳導(dǎo)電膠,，它價格低廉，效果也很好,。 對不鍍膜而直接觀察的樣品,，必須用導(dǎo)電膠來粘固，對于要鍍膜的樣品,，則可以用其他膠水(如萬能膠,、乳膠等)來代替，微細(xì)的樣品(如粉末,、纖維)也可用雙面膠紙來粘貼,。 樣品底面面積較小的樣品(如圓形)，裝臺粘膠時,，不能像圖10-3(a)那樣,，膠水僅涂樣品與樣品臺接觸的那一小部分，這樣不僅樣品不易裝固,，而且鍍膜時產(chǎn)生死角,，金屬膜層與樣品臺不相接，導(dǎo)性電能差,，易產(chǎn)生充電現(xiàn)象,，從而影響觀察和拍照。因此,，應(yīng)多涂點(diǎn)膠,，像圖10-3(b)那樣,，這樣就能保證鍍層在最薄的情況下也能與樣品臺形成連續(xù)的導(dǎo)電膜,，同時也使樣品粘得牢,；樣品粘好后應(yīng)待膠水層內(nèi)外都干透后才進(jìn)行鍍膜和觀察，否則會影響鍍膜效果和污染電鏡鏡筒,，尤其是光欄,。 對于大塊的多角形的厚樣品，裝臺時,，膠水也應(yīng)涂成斜面,。對纖維類樣品，可以像牙刷那樣穿在鉆有孔的樣品臺上,，齊根處涂以膠水加固(觀察橫切面時)或平粘于樣品臺上,，兩端用膠水固定(觀察纖維表面時)。 對于微粒,、粉末類樣品粘膠時應(yīng)盡量避免成團(tuán),，以利于尋找典型圖樣和提高鍍膜效果，對于此類樣品,，可制成稀的懸浮液,，然后滴在樣品臺上，或在樣品臺上粘上雙面膠紙后,，用牙簽纏上棉花蘸取粉末樣品,，再用吹氣球?qū)悠份p輕吹落在樣品臺上，效果也較好,。 總之不論是那類樣品,，都應(yīng)達(dá)到粘膠牢固，便于鍍膜和圖像背景美觀清晰的要求,。
