【科研干貨】生物樣品超薄切片技術(shù)與電鏡觀察（一）——樣品制備
生物樣品超薄切片技術(shù) 一,、超薄切片技術(shù)——為什么做超薄切片 1、為了使電子束穿透樣品,，超薄切片的厚度通常為70nm左右,，約等于紅細(xì)胞直徑的1% 2、在制樣過程中,，樣品的超微結(jié)構(gòu)必須得到完好的保存,，應(yīng)嚴(yán)格防止樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變以及樣品遭受污染等，因此超薄切片室必須非常潔凈,；3,、樣品應(yīng)牢 固地置于直徑為3mm的專用載網(wǎng)上，以便能經(jīng)受電子束的轟擊,，并防止在裝卸過程中的機(jī)械振動(dòng)而損壞,；4、樣品必須干燥且導(dǎo)電,。 二、生物樣品超薄切片技術(shù)——制樣流程 A.接近正方體形狀的樣品顆粒,，約1mmx1mmx1mm； B.接近長方體形狀的樣品條,，約1mmx1mmx3mm,； C.薄片狀樣品，約1mmx2mmx3mm,。 ④操作輕柔——輕柔的操作可減少人為機(jī)械損傷,，盡量避免金屬器具對(duì)組織細(xì)胞的夾持、擠壓和牽拉,。另外，組織細(xì)胞一定要用緩沖液清洗,。 固定劑的主要作用是使蛋白質(zhì),、脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生某種交聯(lián)。理想的固定劑應(yīng)使細(xì)中各種成分都得到良好固定,，但實(shí)際上,，至今還沒有一種能夠把細(xì)胞中的物質(zhì)全部固定的全能固定劑，不同固定劑對(duì)細(xì)胞成分的固定具有選擇性,。 3,、浸洗：醛類固定液固定后，組織中的殘留醛易與四氧化鋨反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)微的小顆粒沉淀,，所以浸洗要徹底,。浸洗液溫度應(yīng)大致與固定液溫度相同。浸洗時(shí)間對(duì)不同的樣品有不同的要求,，但一般樣品浸洗為2-3次,，每次5-10min，并不是時(shí)間越長越好,。 7,、切片：制作超薄切片，需要使用專門的超薄切片機(jī)來完成,。切片厚度一般為70nm左右,，約等于紅細(xì)胞直徑的1%。超薄切片室必須非常潔凈且相對(duì)封閉,，進(jìn)入之前要換干凈的鞋子和工作服,，盡可能減少人員往來走動(dòng)。 點(diǎn)擊上方二維碼
與電鏡觀察（一）
——樣品制備
超薄切片技術(shù)是生物電鏡技術(shù)中最基本,、應(yīng)用最多的樣品制備技術(shù)，也是一個(gè)電鏡實(shí)驗(yàn)室存在與發(fā)展必備的基本技術(shù),。它不僅越來越廣泛地應(yīng)用于不同的模式生物,、不同個(gè)體的發(fā)育階段、不同個(gè)體的器官組織及不同生理和病理情況下的超微結(jié)構(gòu)研究,，而且也是不斷發(fā)展的各種新技術(shù)的基礎(chǔ),。它可以幫助科學(xué)家們更好地研究生物體的結(jié)構(gòu)和功能。這種技術(shù)可以將生物體切成非常薄的切片,，使得科學(xué)家們可以更加清晰地觀察生物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu),。
在本文中，我們將探討超薄切片技術(shù)制備流程,、常用固定劑的介紹以及它在生物學(xué)研究中的應(yīng)用,。透射電鏡觀察對(duì)樣品的要求：
樣品類型：
①材料樣品：有機(jī)高分子材料和無機(jī)粉體材料,、金屬材料和其他無機(jī)材料高分子聚合物（如聚丙烯、高密度聚乙烯,、尼龍等）,；工業(yè)材料如聚合物（橡膠和塑料）以及韌性、硬質(zhì)或脆性材料（金屬或陶瓷）,；
②生物樣品：如細(xì)胞,、組織、病毒,、蛋白質(zhì)等,。
1,、取材：生物樣品的采集亦稱取材,。對(duì)取材過程的基本要求是：確保樣品盡可能接近自然生活狀態(tài)，同時(shí)確保定位準(zhǔn)確,。注意生物樣品的特殊性,。
①定位準(zhǔn)確——取材最重要的操作是定位準(zhǔn)確,，注意組織取材的極性和方向性。
②取材快捷——取材操作要快捷,。樣品在離體后以最快的速率浸入初固定液,，以免長時(shí)間缺血缺氧引起組織細(xì)胞自溶，并防止微生物繁殖導(dǎo)致樣品腐敗,，破壞精細(xì)結(jié)構(gòu),。
③樣品尺寸合適——對(duì)樣品尺寸的限制主要是基于對(duì)固定液穿透能力的考慮，體積一般以約1mm3的為宜,。 
⑤溫度合適——對(duì)于原位固定取材的組織,、離體的新鮮組織或培養(yǎng)的細(xì)胞，緩沖液和固定液的溫度應(yīng)接近生理溫度,。取材后0.5 h左右可將固定的樣品置入4℃冰箱保存,。
2、固定：將新鮮的活組織從生物體取下后,，立即投入固定劑中,，借助化學(xué)藥品的作用，使細(xì)胞保持原有形態(tài)和結(jié)構(gòu),，更好地保存其超微結(jié)構(gòu),。生物樣品的固定技術(shù)包括化學(xué)固定與物理固定（冷凍固定）兩大類。
固定劑的種類：
①醛類固定劑：醛類固定劑包括戊二醛,、丙烯醛,、甲醛、多聚甲醛等,。
②四氧化鋨固定液,。
③其它固定液：包括高錳酸鉀、四氧化釕,、單寧酸等,。
4,、脫水：脫水是用有機(jī)溶劑逐漸將樣品中游離水完全取代的過程，其最終的有機(jī)溶劑必須能較好地與水和包埋劑混溶,。
脫水的目的：
①避免樣品中的水分在鏡筒高真空下汽化引起污染并破壞真空,；
②包埋用試劑大都是非水溶性的，組織內(nèi)存在的游離水會(huì)影響包埋劑的浸透,；
③采用能與水和包埋劑混溶的有機(jī)溶劑替代其它脫水劑,。
脫水劑：所有可以脫水的有機(jī)溶劑之總稱，有乙醇,、丙酮和環(huán)氧丙烷,。電鏡常用的脫水劑為乙醇和丙酮。
脫水步驟：30%乙醇,、50%乙醇,、70%乙醇、90%乙醇,、100%乙醇2次,、100%丙酮2—3次（5—10 min/次）。
5,、浸透：是用包埋劑逐漸取代組織中脫水劑,，使細(xì)胞內(nèi)外空隙被包埋劑填充。經(jīng)過脫水的組織,，先放入不同比例的包埋劑與脫水劑混合液中浸透,，然后放入純包埋劑中浸透，浸透時(shí)間根據(jù)不同樣品和不同包埋劑確定。
6,、包埋：是將浸透好的組織放在填有包埋劑的平板模具或膠囊中,。然后，通過加熱聚合將極小的組織固定在凝固的包埋劑中,，得到樣品包埋塊,，以便進(jìn)行超薄切片。通常包埋劑分為環(huán)氧樹脂類和水溶性樹脂,。
8,、染色：利用某些金屬鹽類與細(xì)胞中各種成分不同程度的結(jié)合的特性,，對(duì)切片樣品進(jìn)行電子染色處理，增加圖像的反差,。常用染色劑有乙酸雙氧鈾,、鉛鹽類染色劑（如檸檬酸鉛）、高錳酸鉀,、硝酸鑭,、釕紅等。
影響生物組織樣品制備成功率最重要的是取材?。?！
本文部分內(nèi)容摘自《生命科學(xué)中的電子顯微鏡技術(shù)》高等教育出版社
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