掃描電鏡樣品的干燥
樣品的制備中,，干燥是最關(guān)鍵的步驟。干燥過程除引起樣品收縮之外，水的表面張力會使樣品表面形貌發(fā)生很大的變化,，這對掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水，是為了包埋劑的滲透(因水不與包埋劑互溶，而乙醇則能互溶),。而在掃描電鏡的樣品制備中，脫水是用表面張力小的乙醇取代表面張力很大的水,，從而使干燥過程對樣品表面產(chǎn)生的影響較少,。然后就是如何設(shè)法使樣品表面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇，這就是干燥,。目前常用的干燥方法主要有空氣干燥法,、臨界點干燥法、冰凍干燥法,、真空干燥法和莰烯干燥法等。 空氣干燥法： 空氣干燥法又稱自然干燥法,，就是將經(jīng)過脫水的樣品,，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。此法的最大優(yōu)點是簡單易行和節(jié)省時間,，它的致命缺點是在干燥過程中,，組織會因脫水劑揮發(fā)時表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此,，此種方法一般只適用于外殼(表面)較為堅硬的樣品,。 在采用空氣干燥時，為了減少樣品的收縮變形,，除使用易揮發(fā)和表面張力小的脫水劑如乙醇,、丙酮等外，還應(yīng)使樣品得到充分固定,，特別是須經(jīng)四氧化鋨固定效果才較好,。因為它會使組織變得較為堅硬，使收縮變形減少,。 然而,，空氣干燥引起的收縮并非完全不利，有時可以通過收縮使細(xì)胞之間相互剝離,，從而能清楚地觀察到一個個單獨存在的細(xì)胞及其表面結(jié)構(gòu),。此外，還可通過細(xì)胞成份在干燥時的收縮，觀察到細(xì)胞內(nèi)的線粒體,、細(xì)胞核等成份的存在,。但這種機會很少，而且因收縮帶來的不利是主要的,，所以,，目前很少采用。 臨界點干燥法： 臨界點干燥法是一種消除了物相界面(液相／氣相),，也就是消除了表面張力來源的干燥方法,。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷,，此法所用的儀器結(jié)構(gòu)不甚復(fù)雜,，操作較為方便，所用的時間也不算長,，一般約2h左右即可完成,，所以，是最為常用的方法,。 物質(zhì)的臨界點是1822年由Charles cagridde La Tour發(fā)現(xiàn)的,。他將不同的液體分別裝進玻璃試管并密封起來，然后一邊轉(zhuǎn)動一邊加熱,，這時,，他發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，試管內(nèi)的液相和氣相之間的彎月面開始變得模糊起來,，只有在試管冷卻之后,，彎月面才又重新出現(xiàn)。每種液體都存在某一溫度,，在這一溫度時,，液相的彎月面完全消失。 那么,，彎月面的消失意味著什么呢?它意味著液相和氣相之間的界面沒有了,，之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象，是因為在密封的容器里,，液體受熱膨脹,，而氣體本身被壓縮，最后在某一特定的溫度和壓力下,，液體由于膨脹,，氣體由于被壓縮而使兩者的密度相同，因而相互混合成一種均一的流體,，原先存在它們之間的彎月面(即液面)就消失了,，表面張力也自然消失了,。因此，所謂臨界點,，就是指使物質(zhì)的氣態(tài)和液態(tài)兩相之間達(dá)到相同密度,，成為均一流體狀態(tài)時的溫度和壓力的總稱。此時的溫度稱臨界溫度,；此時的壓力稱臨界壓力,。 不同的物質(zhì)都有其特定的臨界點，一般用于掃描電鏡樣品臨界點干燥的置換劑的臨界溫度和壓力見表10-1,。如果在臨介點進行干燥,，由于表面張力消失就不會造成樣品表面的損傷。但進行臨界點干燥,，需用專用的臨界點干燥器,。具體處理步驟如下： 固定脫水 按透射電鏡常規(guī)制樣方法進行。 純丙酮置換乙醇 如樣品是用乙醇脫水的,，在脫水至100％后,，用純丙酮置換15～20min。 中間液處理 即在用丙酮置換乙醇后,用醋酸異戊酯(乙酸異戊B8)處理15-80min(也可以過夜)置換丙酶,。由于醋酸異戊酯與液態(tài)二氧化碳能互溶,，使液態(tài)二氧化碳容易滲入樣品中。 裝樣： 將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中,，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯,，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣,。(注：在裝樣前，應(yīng)先打開儀器電源,，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0℃處預(yù)冷10～15min,，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進入樣品杯中)。注入液體二氧化碳 依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進氣閥在0～10℃下,，向樣品杯注入液體二氧化碳,。 漂洗： 當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的50％(通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度)時,，關(guān)閉儀器進氣閥,，靜置15～20min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散,，然后,，打開儀器排氣流量計閥門和進氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右,，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳)再關(guān)閉排氣閥,；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的80％左右,，關(guān)閉進液閥，停止充液,。 加溫置換： 將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20℃處經(jīng)15～20min后,，由于溫度升高，杯內(nèi)液體二氧化碳逐漸氣化,，因此,，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置換,。 氣化： 將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上(35～40℃),，此時隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸增加,，達(dá)到二氧化碳的臨介點,，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)到7134Pa時,，經(jīng)5min后,，即可排氣。 排氣 在保持溫度不變的條件下(即不關(guān)電源),，打開流量計的排氣閥門,，以1.0～1.51／min的速度排氣(速度慢些更好)。約經(jīng)45～60min后,，排氣完畢,，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調(diào)節(jié)至室溫約5rain后,，即可取出樣品裝臺鍍膜(若不能立即裝臺,，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存)。 臨界點干燥的成敗如何,；與每一步的操作有很大關(guān)系,，因此，操作時應(yīng)注意以下事項： 在樣品放進樣品杯前,，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至0～10℃,，因為溫度過高，充入的液體二氧化碳會立即氣化膨脹,，壓力增加,，妨礙二氧化碳液體繼續(xù)進入樣品杯。 樣品不宜過濕,，但也不能讓其表面干涸,，應(yīng)在半干半濕時送入樣品杯。因為過濕表明乙酸異戊脂太多會干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂,，影響干燥效果,。而過干又會因空氣干燥而造成樣品己變形,，再進行臨介點干燥也沒有意義了。 一次加入的樣品不宜過多,，以免帶進過多的中間液,，使樣品干燥不完全，另外,，樣品過多使二氧化碳量充入不足而達(dá)不到臨界點,。 充入液體二氧化碳的量要足。因為充液量不足,，達(dá)不到臨界值,，起不到臨界點干燥作用，一般充液量應(yīng)達(dá)樣品杯容積的2/3左右,。 在加溫氣化時,，實際操作溫度應(yīng)超過臨界值，以保證達(dá)到充分的臨界狀態(tài),。 "開",、"閉"閥門時，動作要輕緩,，盡量防止二氧化碳液對樣品產(chǎn)生突然沖擊而造成樣品損傷,。因此，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或濾紙,。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢,，一般放氣時間應(yīng)在．4Omin以上，有時也可以放氣過夜或過中午,。 二氧化碳臨界點干燥法除用液體二氧化碳外,，也有用固體二氧化碳(干冰)作干燥介質(zhì)的。與液體二氧化碳比較,，固體二氧化碳有以下優(yōu)點: 有利于微小樣品的干燥,，例如像玻璃片上的游離細(xì)胞，若用液體二氧化碳干燥,，由于二氧化碳?xì)怏w急劇地噴入樣品杯內(nèi)很可能使樣品被吹掉，而用固體二氧化碳干燥,，則完全沒有這種危險,。 不需要用鋼瓶，鋼瓶很重,，搬運麻煩,；用固體二氧化碳時，有適當(dāng)大小的保溫瓶(如冰壺)就可以了,，因此很方便,。 能保證二氧化碳裝滿樣品室,，即使用固體二氧化碳時，每次都能準(zhǔn)確地放入足夠酌量,，而不會像使用液體二氧化碳時由于鋼瓶中二氧化碳不足,，充不進樣品杯內(nèi)，使樣品干燥不完全而造成損傷,。 夏天使用方便 在使用液體二氧化碳時,，若室溫超過臨界溫度，液體二氧化碳難以從鋼瓶進入樣品室,，而固體二氧化碳則不受室溫高低的影響,，即無論多熱的天氣也能放進足夠量。 不污染樣品 使用液體時,，往往由于鋼瓶內(nèi)有鐵銹粉末充進樣品杯而污染樣品,，而固體二氧化碳則無此種污染。 固體二氧化碳臨界點干燥法除使用專門裝置外,，也可用任何一種液體臨界點干燥器,，不過由于液體臨界點干燥器的樣品室較小，操作起來不大方便,。固體二氧化碳臨界點干燥法的樣品處理{固定,、脫水等)與液體二氧化碳臨界干燥法相同，所不同的是在于干燥時的具體操作,。其操作步驟是：先將干冰用加熱器切成樣品杯容積大小的圓柱體(也可敲成碎塊或粉末),，放于樣品籠的頂部，蓋好樣品杯蓋,，然后加熱到15℃,，使干冰熔化成液體二氧化碳，這時干燥器內(nèi)的壓力上升,，再加熱到40C,，使液體二氧化碳逐漸氣化，壓力繼續(xù)上升達(dá)到臨界值,，幾分鐘后即可排氣(溫度不變),。當(dāng)氣體全部排出，壓力回到零后,，即取出樣品,，裝臺鍍膜觀察。 冰凍干燥法： 冰凍干燥是將經(jīng)冰凍的樣品置于高真空中通過升華,，除去樣品中的水分或脫水劑的過程,。冰凍干燥的基礎(chǔ)是冰(或固態(tài)溶劑)從樣品中升華，也就是使水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài),，不經(jīng)過中間的液態(tài),不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用,，因此,，能較好地避免或減少了在干燥過程中對樣品的損傷。冰凍干燥方法有兩種,，即含水樣品直接冰凍干燥和樣品脫水后從有機溶劑中冰凍干燥,。 含水樣品直接冰凍干燥法: 此法相對于臨界點干燥有其明顯優(yōu)點，即能直接使含水樣品冰凍干燥,，不需要用有機溶劑脫水和置換,，避免了無極性溶劑對樣品成份的抽提作用，因此,，不會使樣品收縮和膜結(jié)構(gòu)或表面物質(zhì)產(chǎn)生穿蝕,。如用此法干燥植物葉的樣品，葉面角質(zhì)層能保持自然狀態(tài),，從而得到好的實驗樣品,。 含水樣品冰凍干燥的步驟如下： 取材固定，按常規(guī)方法進行,。 冰凍保護劑滲透 將樣品置于10％～20％的二甲基亞砜(DWSO)水溶液或15％～40％的甘油水溶液,，或氯仿中浸泡數(shù)小時。 驟冷 將經(jīng)保護劑處理過的樣品迅速投入到用液氮預(yù)冷到一150℃的氟利昂12或氟利昂22冷凍劑中,，使樣品中的水分在片刻間凍結(jié),。 升華干燥 將已驟冷凍結(jié)的樣品移到冰凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣臺上(保持一70C以下),抽真空(真空度為10～10-1Pa)，經(jīng)幾小時或數(shù)天后,，樣品即達(dá)到干燥,； 裝臺鍍膜 先將冰凍干燥器的樣品臺加熱至室溫，然后將干燥器放氣,，取出樣品迅速裝臺粘樣,，送入鍍膜儀中鍍膜。 但是這種方法也有其不足之處,，就是干燥時間太長,，如單層細(xì)胞也要幾小時才能達(dá)到干燥，而幾毫米厚的組織塊可能要持續(xù)干燥一至數(shù)天,，同時要判斷是否干燥也較為困難,，冰凍過程中會形成冰晶，使細(xì)胞成份因受冰晶擠壓而產(chǎn)生移位和變形,，造成人為的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),。因此必須采取一些防止這一不良情況產(chǎn)生的措施，以使樣品的損傷減少到可以忽略的程度,。 為了防止冰晶的形成，可采用以下辦法：①用驟冷劑提高冰凍速度,。常用的驟冷劑有氟利昂12和氟利昂22,；此外,，液態(tài)一固態(tài)氮的半凝固狀混合物的溫度可低至-210℃，因此可作為驟冷劑,；②用冷凍保護劑如二甲基亞砜,、甘油、明膠或氯仿處理樣品,，能抑制水分子集合成冰晶和限制冰晶的大小,，以保護樣品免受冰晶的損傷，尤其以氯仿處理的效果為好,，因為氯仿易于揮發(fā),，不留在樣品表面而影響觀察。此外,，透射電鏡冰凍制樣技術(shù)中的冷凍方法,，也適用于掃描電鏡。 樣品脫水后的冰凍干燥: 這種方法是用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機溶劑如乙醚,、氯仿,、氟利昂113等中，然后連同這些溶劑一起冰凍并在真空中升華(直接用于脫水的乙醇作為冰凍干燥劑也有效)而達(dá)到樣品干燥的,；這種方法相對于前一種方法有下列優(yōu)點,；即有機溶劑在冰凍時形成非晶體固態(tài)，不像水那樣結(jié)冰時膨脹,，因此不會產(chǎn)生冰晶對樣品的損傷,。有機溶劑能以比水快得多的速度從固態(tài)中升華，因此,，干燥時間比上一方法短得多,，不需要專用的冰凍干燥裝置，只用普通的真空干燥器加一塊金屬塊作樣品臺即可,。但此法也有不足之處,，就是有機溶劑對樣品成份有抽提作用，易造成部分內(nèi)含物丟失,。 此法的操作程序與前法基本相同,，只是無需用冷凍保護劑處理而已。現(xiàn)將幾種方法介紹如下： 氟利昂TF冷凍干燥法： 固定脫水按常規(guī)方法進行,。,、 置換： 按圖中所示的比例配好氟利昂TF和酒精混合液，并通過這些混合液將樣品逐步引入100％氟利昂TF,。 冷凍 把樣品浸入液氮中冷凍,。 干燥 將樣品放在預(yù)先冷卻的鋁座上，再移入真空噴鍍儀中抽真空(約1Pa)，經(jīng)0～20min后即完全干燥,。90min后鋁座變?yōu)槭覝?，即取出樣品、裝臺,、鍍膜觀察,。 乙腈(acetonitrile)真空干燥法： 這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時會冷卻固化這一性質(zhì)，將樣品干燥的很獨特的方法,。其操作步驟如下： 固定,、水洗按常規(guī)方法進行。 脫水 使用上升的系列乙腈(50％～100％)脫水各20min,。 滲透 在容量約Iml的鋁制容器中裝滿乙腈,，并投入樣品。 升華 把容器放入真空噴鍍儀中抽真空,，此時由于乙腈急速蒸發(fā)而使容器急劇冷卻,，其中乙腈也變成冰狀固體。然后繼續(xù)抽真空,，使乙腈升華,， 約經(jīng)30min，樣品即達(dá)干燥,。 待容器回升到室溫后,，即可取出樣品裝臺鍍膜進行觀察。 據(jù)田中敬一報道此法干燥的效果與臨界點干燥沒有什么不同,。 茨烯干燥法 莰烯是一種樟腦類無色結(jié)晶體,，能溶于醚、環(huán)乙烷,、環(huán)己烯和氯仿中,，室溫下呈固體狀，能在較低的溫度下升華,，從固態(tài)直接變成氣態(tài),，表面張力小，故經(jīng)它干燥的樣品較松軟,，變形小,，操作也較簡便。 莰烯干燥法是由Warrens．Buk于1971年提出的,，其操作步驟如下： 取新鮮材料迅速投入0．1mol/L磷酸緩沖液中漂洗,，然后投入5％的戊二醛(用磷酸緩沖液配制的pH7.4)中固定1h。 轉(zhuǎn)至加有5.4％蔗糖的0．1mol/L磷酸緩沖液中,，在冷凍溫度下過夜,。 用l％的四氧化鋨(磷酸緩沖液配制)溶液中固定2h,。 用磷酸緩沖液或雙蒸水漂洗2～3次，每次,、15min,。 用30％，50％,，70％，90％,，95％和100％丙酮脫水,，每級15min。 用100％的苯脫酯,。 在1：1苯與環(huán)氧丙烷中浸泡15min,，再轉(zhuǎn)至純環(huán)氧丙烷中，在45℃下經(jīng)20min后,，轉(zhuǎn)入預(yù)先在水浴箱中加溫成液體的莰烯中浸透,，取出樣品裝臺。 放入真空干燥器中,，在室溫下抽真空1h左右,，使莰烯直接從固體中升華，然后鍍膜,。
