生物樣品掃描電鏡制樣技術(shù)
無(wú)論是透射電鏡或是掃描電鏡,，樣品均處于電鏡鏡筒的真空之中,。而大多數(shù)的生物樣品都是柔軟而且含大量水分的,。因此，也和透射電鏡的樣品一樣,，在進(jìn)行掃描電鏡觀察前,，必須對(duì)生物樣品作相應(yīng)的處理。 掃描電鏡的功能很多,，不同的功能對(duì)樣品的要求不同,。例如二次電子像與背散射電子像和吸收電子像對(duì)樣品的要求基本相同，而與X射線(xiàn)微區(qū)分析對(duì)樣品的要求相差較遠(yuǎn),。我們首先介紹二次電子像的生物樣品制備技術(shù),。此外，由于樣品的性質(zhì)不同,，其處理方法和程序也有不同,。主要分兩大類(lèi),，一類(lèi)為含水量少的硬組織,，如毛發(fā)、牙齒及植物的花粉,、孢子,、種子等。此類(lèi)樣品一般含硅質(zhì),、鈣質(zhì),，角質(zhì)，砝瑯質(zhì)和纖維素等成份,，所以通常只經(jīng)過(guò)表面清潔,、裝臺(tái)(粘膠)、導(dǎo)電處理等簡(jiǎn)單過(guò)程即可進(jìn)行觀察,。如要觀察其斷面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)時(shí),，經(jīng)斷裂、解剖或酶消化,、蝕刻等再裝臺(tái),、鍍膜處理，即可進(jìn)行觀察拍照,。另-類(lèi)為含水分較多的軟組織,，如大多數(shù)的動(dòng)植物器官、組織及細(xì)菌等均屬此類(lèi),。對(duì)于此類(lèi)樣品,，在金屬鍍膜前，一般都需經(jīng)過(guò)固定、脫水,、干燥等處理,，如不經(jīng)處理或處理不當(dāng)，就會(huì)造成樣品損傷和變形,，出現(xiàn)各種假像,，因此對(duì)每一處理步驟都應(yīng)給予重視。 但是,，不管是那一類(lèi)樣品的制備,，都應(yīng)達(dá)到以下要求： 盡可能保持樣品活體時(shí)的形貌和結(jié)構(gòu)，以便如實(shí)地反映樣品本來(lái)面目,。 在樣品的干燥過(guò)程盡可能減少樣品變形,。 樣品表面應(yīng)有良好導(dǎo)電性能和二次電子發(fā)射率，以防止和減少樣品的荷電效應(yīng),。 樣品的前期處理 掃描電鏡樣品的前期處理主要包括表面清潔,、固定、漂洗和脫水等過(guò)程,。而每一過(guò)程的處理方法基本上都是沿用透射電鏡樣品的處理方法的,，所以，這里不一一再作詳述,。但是,，由于兩種電鏡觀察的要求不同，因此,，在處理中也有不同之處： 1.透射電鏡主要研究樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)要求內(nèi)部結(jié)構(gòu)保存好,，因而樣品宜盡可能小使固定液能迅時(shí)滲入固定。掃描電鏡觀察表面形貌,，而且為了操作方便選取較大樣品,。一般在8～10mm2左右，高度可達(dá)5mm,。 2. 掃描電鏡要求完整且清潔表面,，但是在許多樣品的表面常附有粘液、血液,、組織液及灰塵等雜物,，妨礙著觀察，以致造成對(duì)圖像的錯(cuò)誤解釋?zhuān)?，在固定前都必須特別做好表面的清潔工作,。 以下簡(jiǎn)介前期處理方法： 清潔'：對(duì)樣品的清潔可根據(jù)不同的樣品采用不同的方法，其中常用的方法有: 表面正常干燥的樣品如葉,、花瓣,、莖等蠟葉標(biāo)本,，可用吹氣球或用除塵器吹凈，也可用軟毛筆輕掃等方法除去表面的灰塵和其它雜物,，但需注意不要損傷樣品,，吹風(fēng)和清掃的力量取決于樣品的硬度和污染的程度。 一般動(dòng)植物組織,，可用蒸餾水,、生理鹽水或緩沖液漂洗或沖洗。至于采用何種清潔液清洗,，要視組織本身對(duì)清洗液滲透壓變化的敏感程度而定,，如用緩沖液清洗時(shí)，應(yīng)與配制固定液的緩沖液一致,，否則會(huì)因性質(zhì)不同而產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)從而影響固定效果,。 對(duì)有油脂分泌物和蠟質(zhì)覆蓋層的樣品如毛發(fā)、蚧蟲(chóng)等,，應(yīng)采用有機(jī)溶劑反復(fù)浸洗,。 對(duì)一些附有粘液的組織可采用酶解法或其它試劑處理來(lái)清洗，如一般組織可用木瓜蛋白酶和淀粉酶清洗,；腸粘膜可用糜蛋白酶清洗,；用胰蛋白酶可分離和清洗胃粘膜的細(xì)胞。有些組織也可用試劑進(jìn)行清洗,，如要分離神經(jīng)細(xì)胞可用稀釋的乙二胺四醋酸處理,，用甘油和稀釋的乙醇延長(zhǎng)浸漬時(shí)間可以從分泌乳腺中除去乳汁等。 對(duì)微小的樣品要用離心法或放在用鎳過(guò)濾網(wǎng)制的小容器中清洗,。 對(duì)于特殊的樣品還須用特殊的方法進(jìn)行清洗。 固定: 樣品的固定,、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同,，但由于掃描電鏡觀察的是樣品的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌,，因此,，在固定、漂洗和脫水過(guò)程也與透射電鏡樣品處理有不同之處,。 除采用戊二醛,、四氧化鋨、高錳酸鉀等固定液進(jìn)行固定外,，還可采用下列幾種固定液： Sjodstrand固定液： A液：氯化鈉40.3g+氯化鉀2.1g+鈣0.9g+雙蒸鎦水500ml B液：醋酸鈉9.714g+凡羅那鈉(Veronal)14.74g+雙蒸餾水500m1 使用時(shí)吸取A液10ml,，B液3.4ml，再加0/1mol/L鹽酸11ml和鋨酸05g+50ml蒸餾水 Dalton氏固定液： 此種固定液為4％重鉻酸鉀(pH7.2)與3.4％氯化鈉等量混和后,，再與2％四氧化鋨等量混使即得,。 這種固定液無(wú)沉渣,，對(duì)樣品損傷少。 在能保持樣品不變形的前提下,，不少樣品(特別是植物樣品)采用戊二醛單固定即可,。 為了加強(qiáng)固定效果，還可將幾種不同的固定液配合使用,，進(jìn)行雙固定或多次固定(尤其是動(dòng)物樣品),；如用用戊二醛作前固定，用鋨酸作后固定,。 脫水：脫水劑常用乙醇和丙酮,。丙酮能使組織塊變硬，是它的優(yōu)點(diǎn),。 樣品的干燥 生物樣品的制備中,，干燥是最關(guān)鍵的步驟。干燥過(guò)程除引起樣品收縮之外,，水的表面張力會(huì)使樣品表面形貌發(fā)生很大的變化,，這對(duì)掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水,，是為了包埋劑的滲透(因水不與包埋劑互溶,，而乙醇則能互溶)。而在掃描電鏡的樣品制備中,，脫水是用表面張力小的乙醇取代表面張力很大的水,，從而使干燥過(guò)程對(duì)樣品表面產(chǎn)生的影響較少。然后就是如何設(shè)法使樣品表面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇,，這就是干燥,。目前常用的干燥方法主要有空氣干燥法、臨界點(diǎn)干燥法,、冰凍干燥法,、真空干燥法和莰烯干燥法等。 空氣干燥法 空氣干燥法又稱(chēng)自然干燥法,，就是將經(jīng)過(guò)脫水的樣品,，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。此法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行和節(jié)省時(shí)間,，它的致命缺點(diǎn)是在干燥過(guò)程中,，組織會(huì)因脫水劑揮發(fā)時(shí)表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此,，此種方法一般只適用于外殼(表面)較為堅(jiān)硬的樣品,。 在采用空氣干燥時(shí)，為了減少樣品的收縮變形,，除使用易揮發(fā)和表面張力小的脫水劑如乙醇,、丙酮等外,，還應(yīng)使樣品得到充分固定，特別是須經(jīng)四氧化鋨固定效果才較好,。因?yàn)樗鼤?huì)使組織變得較為堅(jiān)硬,，使收縮變形減少。 然而,，空氣干燥引起的收縮并非完全不利,，有時(shí)可以通過(guò)收縮使細(xì)胞之間相互剝離，從而能清楚地觀察到一個(gè)個(gè)單獨(dú)存在的細(xì)胞及其表面結(jié)構(gòu),。此外,，還可通過(guò)細(xì)胞成份在干燥時(shí)的收縮，觀察到細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體,、細(xì)胞核等成份的存在,。但這種機(jī)會(huì)很少，而且因收縮帶來(lái)的不利是主要的,，所以,，目前很少采用。 臨界點(diǎn)干燥法 臨界點(diǎn)干燥法是一種消除了物相界面(液相／氣相),，也就是消除了表面張力來(lái)源的干燥方法,。這種方法由于沒(méi)有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷,，此法所用的儀器結(jié)構(gòu)不甚復(fù)雜,，操作較為方便，所用的時(shí)間也不算長(zhǎng),，一般約2h左右即可完成,，所以，是最為常用的方法,。 物質(zhì)的臨界點(diǎn)是1822年由Charles cagridde La Tour發(fā)現(xiàn)的,。他將不同的液體分別裝進(jìn)玻璃試管并密封起來(lái)，然后一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊加熱,，這時(shí)，他發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高,，試管內(nèi)的液相和氣相之間的彎月面開(kāi)始變得模糊起來(lái),，只有在試管冷卻之后，彎月面才又重新出現(xiàn),。每種液體都存在某一溫度,，在這一溫度時(shí)，液相的彎月面完全消失,。 那么,，彎月面的消失意味著什么呢?它意味著液相和氣相之間的界面沒(méi)有了,，之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象，是因?yàn)樵诿芊獾娜萜骼?，液體受熱膨脹,，而氣體本身被壓縮，最后在某一特定的溫度和壓力下,，液體由于膨脹,，氣體由于被壓縮而使兩者的密度相同，因而相互混合成一種均一的流體,，原先存在它們之間的彎月面(即液面)就消失了,，表面張力也自然消失了。因此,，所謂臨界點(diǎn),，就是指使物質(zhì)的氣態(tài)和液態(tài)兩相之間達(dá)到相同密度，成為均一流體狀態(tài)時(shí)的溫度和壓力的總稱(chēng),。此時(shí)的溫度稱(chēng)臨界溫度,；此時(shí)的壓力稱(chēng)臨界壓力。 不同的物質(zhì)都有其特定的臨界點(diǎn),，一般用于掃描電鏡樣品臨界點(diǎn)干燥的置換劑的臨界溫度和壓力見(jiàn)表10-1,。如果在臨介點(diǎn)進(jìn)行干燥，由于表面張力消失就不會(huì)造成樣品表面的損傷,。但進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥,，需用專(zhuān)用的臨界點(diǎn)干燥器。具體處理步驟如下： 1.固定脫水 按透射電鏡常規(guī)制樣方法進(jìn)行,。 2.純丙酮置換乙醇 如樣品是用乙醇脫水的,，在脫水至100％后，用純丙酮置換15～20min,。 3.中間液處理 即在用丙酮置換乙醇后,用醋酸異戊酯(乙酸異戊B8)處理15-80min(也可以過(guò)夜)置換丙酶,。由于醋酸異戊酯與液態(tài)二氧化碳能互溶，使液態(tài)二氧化碳容易滲入樣品中,。 4. 裝樣 將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中,，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內(nèi),，蓋上蓋并擰緊以防漏氣,。(注：在裝樣前，應(yīng)先打開(kāi)儀器電源,，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0℃處預(yù)冷10～15min,，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進(jìn)入樣品杯中)。 5. 注入液體二氧化碳 依次打開(kāi)二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進(jìn)氣閥在0～10℃下,，向樣品杯注入液體二氧化碳,。 6. 漂洗 當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的50％(通過(guò)刻度尺觀察,，以液面超過(guò)樣品籠為度)時(shí)，關(guān)閉儀器進(jìn)氣閥,，靜置15～20min,，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散，然后,，打開(kāi)儀器排氣流量計(jì)閥門(mén)和進(jìn)氣閥門(mén),，讓其邊排氣邊充液10min左右，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳)再關(guān)閉排氣閥,；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的80％左右,，關(guān)閉進(jìn)液閥，停止充液,。 7. 加溫置換 將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20℃處經(jīng)15～20min后,，由于溫度升高，杯內(nèi)液體二氧化碳逐漸氣化,，因此,，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置換,。 8.氣化 將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上(35～40℃),，此時(shí)隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸增加,，達(dá)到二氧化碳的臨介點(diǎn),，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)到7134Pa時(shí),，經(jīng)5min后,，即可排氣。 9. 排氣 在保持溫度不變的條件下(即不關(guān)電源),，打開(kāi)流量計(jì)的排氣閥門(mén),，以1.0～1.51／min的速度排氣(速度慢些更好)。約經(jīng)45～60min后,，排氣完畢,，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調(diào)節(jié)至室溫約5rain后,，即可取出樣品裝臺(tái)鍍膜(若不能立即裝臺(tái),，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存)。 臨界點(diǎn)干燥的成敗如何,；與每一步的操作有很大關(guān)系，因此,，操作時(shí)應(yīng)注意以下事項(xiàng)： 1.在樣品放進(jìn)樣品杯前,，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至0～10℃,，因?yàn)闇囟冗^(guò)高，充入的液體二氧化碳會(huì)立即氣化膨脹,，壓力增加,，妨礙二氧化碳液體繼續(xù)進(jìn)入樣品杯。 2.樣品不宜過(guò)濕,，但也不能讓其表面干涸,，應(yīng)在半干半濕時(shí)送入樣品杯。因?yàn)檫^(guò)濕表明乙酸異戊脂太多會(huì)干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂,，影響干燥效果,。而過(guò)干又會(huì)因空氣干燥而造成樣品己變形，再進(jìn)行臨介點(diǎn)干燥也沒(méi)有意義了,。 3.一次加入的樣品不宜過(guò)多,，以免帶進(jìn)過(guò)多的中間液，使樣品干燥不完全,，另外,，樣品過(guò)多使二氧化碳量充入不足而達(dá)不到臨界點(diǎn)。 4.充入液體二氧化碳的量要足,。因?yàn)槌湟毫坎蛔?，達(dá)不到臨界值，起不到臨界點(diǎn)干燥作用,，一般充液量應(yīng)達(dá)樣品杯容積的2/3左右,。 5.在加溫氣化時(shí)，實(shí)際操作溫度應(yīng)超過(guò)臨界值,，以保證達(dá)到充分的臨界狀態(tài),。 6."開(kāi)"、"閉"閥門(mén)時(shí),，動(dòng)作要輕緩,，盡量防止二氧化碳液對(duì)樣品產(chǎn)生突然沖擊而造成樣品損傷。因此,，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或?yàn)V紙,。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢，一般放氣時(shí)間應(yīng)在．4Omin以上,，有時(shí)也可以放氣過(guò)夜或過(guò)中午,。 二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除用液體二氧化碳外，也有用固體二氧化碳(干冰)作干燥介質(zhì)的,。與液體二氧化碳比較,，固體二氧化碳有以下優(yōu)點(diǎn): 1.有利于微小樣品的干燥，例如像玻璃片上的游離細(xì)胞，若用液體二氧化碳干燥,，由于二氧化碳?xì)怏w急劇地噴入樣品杯內(nèi)很可能使樣品被吹掉,，而用固體二氧化碳干燥，則完全沒(méi)有這種危險(xiǎn),。 2.不需要用鋼瓶,，鋼瓶很重，搬運(yùn)麻煩,；用固體二氧化碳時(shí),，有適當(dāng)大小的保溫瓶(如冰壺)就可以了，因此很方便,。 3. 能保證二氧化碳裝滿(mǎn)樣品室,，即使用固體二氧化碳時(shí)，每次都能準(zhǔn)確地放入足夠酌量,，而不會(huì)像使用液體二氧化碳時(shí)由于鋼瓶中二氧化碳不足,，充不進(jìn)樣品杯內(nèi)，使樣品干燥不完全而造成損傷,。 4.夏天使用方便 在使用液體二氧化碳時(shí),，若室溫超過(guò)臨界溫度，液體二氧化碳難以從鋼瓶進(jìn)入樣品室,，而固體二氧化碳則不受室溫高低的影響,，即無(wú)論多熱的天氣也能放進(jìn)足夠量。 5.不污染樣品 使用液體時(shí),，往往由于鋼瓶?jī)?nèi)有鐵銹粉末充進(jìn)樣品杯而污染樣品,，而固體二氧化碳則無(wú)此種污染。 固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除使用專(zhuān)門(mén)裝置外,，也可用任何一種液體臨界點(diǎn)干燥器,，不過(guò)由于液體臨界點(diǎn)干燥器的樣品室較小，操作起來(lái)不大方便,。固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法的樣品處理{固定,、脫水等)與液體二氧化碳臨界干燥法相同，所不同的是在于干燥時(shí)的具體操作,。其操作步驟是：先將干冰用加熱器切成樣品杯容積大小的圓柱體(也可敲成碎塊或粉末),，放于樣品籠的頂部，蓋好樣品杯蓋,，然后加熱到15℃,，使干冰熔化成液體二氧化碳，這時(shí)干燥器內(nèi)的壓力上升,，再加熱到40C,，使液體二氧化碳逐漸氣化,，壓力繼續(xù)上升達(dá)到臨界值，幾分鐘后即可排氣(溫度不變),。當(dāng)氣體全部排出,，壓力回到零后，即取出樣品,，裝臺(tái)鍍膜觀察。 冰凍干燥法 冰凍干燥是將經(jīng)冰凍的樣品置于高真空中通過(guò)升華,，除去樣品中的水分或脫水劑的過(guò)程,。冰凍干燥的基礎(chǔ)是冰(或固態(tài)溶劑)從樣品中升華，也就是使水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài),，不經(jīng)過(guò)中間的液態(tài),不存在氣相和液相之間的表面張力對(duì)樣品的作用,，因此，能較好地避免或減少了在干燥過(guò)程中對(duì)樣品的損傷,。冰凍干燥方法有兩種,，即含水樣品直接冰凍干燥和樣品脫水后從有機(jī)溶劑中冰凍干燥。 含水樣品直接冰凍干燥法: 此法相對(duì)于臨界點(diǎn)干燥有其明顯優(yōu)點(diǎn),，即能直接使含水樣品冰凍干燥,，不需要用有機(jī)溶劑脫水和置換，避免了無(wú)極性溶劑對(duì)樣品成份的抽提作用,，因此,，不會(huì)使樣品收縮和膜結(jié)構(gòu)或表面物質(zhì)產(chǎn)生穿蝕。如用此法干燥植物葉的樣品,，葉面角質(zhì)層能保持自然狀態(tài),，從而得到好的實(shí)驗(yàn)樣品。 含水樣品冰凍干燥的步驟如下： 1.取材固定,，按常規(guī)方法進(jìn)行,。 2.冰凍保護(hù)劑滲透 將樣品置于10％～20％的二甲基亞砜(DWSO)水溶液或15％～40％的甘油水溶液，或氯仿中浸泡數(shù)小時(shí),。 3.驟冷 將經(jīng)保護(hù)劑處理過(guò)的樣品迅速投入到用液氮預(yù)冷到一150℃的氟利昂12或氟利昂22冷凍劑中,，使樣品中的水分在片刻間凍結(jié)。 4.升華干燥 將已驟冷凍結(jié)的樣品移到冰凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣臺(tái)上(保持一70C以下),抽真空(真空度為10～10-1Pa),，經(jīng)幾小時(shí)或數(shù)天后,，樣品即達(dá)到干燥； 5.裝臺(tái)鍍膜 先將冰凍干燥器的樣品臺(tái)加熱至室溫,，然后將干燥器放氣,，取出樣品迅速裝臺(tái)粘樣，送入鍍膜儀中鍍膜,。 但是這種方法也有其不足之處,，就是干燥時(shí)間太長(zhǎng)，如單層細(xì)胞也要幾小時(shí)才能達(dá)到干燥，而幾毫米厚的組織塊可能要持續(xù)干燥一至數(shù)天,，同時(shí)要判斷是否干燥也較為困難,，冰凍過(guò)程中會(huì)形成冰晶，使細(xì)胞成份因受冰晶擠壓而產(chǎn)生移位和變形,，造成人為的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),。因此必須采取一些防止這一不良情況產(chǎn)生的措施，以使樣品的損傷減少到可以忽略的程度,。 為了防止冰晶的形成,，可采用以下辦法：①用驟冷劑提高冰凍速度。常用的驟冷劑有氟利昂12和氟利昂22,；此外,，液態(tài)一固態(tài)氮的半凝固狀混合物的溫度可低至-210℃，因此可作為驟冷劑,；②用冷凍保護(hù)劑如二甲基亞砜,、甘油、明膠或氯仿處理樣品,，能抑制水分子集合成冰晶和限制冰晶的大小,，以保護(hù)樣品免受冰晶的損傷，尤其以氯仿處理的效果為好,，因?yàn)槁确乱子趽]發(fā),，不留在樣品表面而影響觀察。此外,，透射電鏡冰凍制樣技術(shù)中的冷凍方法,，也適用于掃描電鏡。 樣品脫水后的冰凍干燥: 這種方法是用乙醇或丙酮脫水后過(guò)渡到某些易揮發(fā)的有機(jī)溶劑如乙醚,、氯仿,、氟利昂113等中，然后連同這些溶劑一起冰凍并在真空中升華(直接用于脫水的乙醇作為冰凍干燥劑也有效)而達(dá)到樣品干燥的,；這種方法相對(duì)于前一種方法有下列優(yōu)點(diǎn),；即有機(jī)溶劑在冰凍時(shí)形成非晶體固態(tài)，不像水那樣結(jié)冰時(shí)膨脹,，因此不會(huì)產(chǎn)生冰晶對(duì)樣品的損傷,。有機(jī)溶劑能以比水快得多的速度從固態(tài)中升華，因此,，干燥時(shí)間比上一方法短得多,，不需要專(zhuān)用的冰凍干燥裝置，只用普通的真空干燥器加一塊金屬塊作樣品臺(tái)即可,。但此法也有不足之處,，就是有機(jī)溶劑對(duì)樣品成份有抽提作用,，易造成部分內(nèi)含物丟失。 此法的操作程序與前法基本相同,，只是無(wú)需用冷凍保護(hù)劑處理而已?，F(xiàn)將幾種方法介紹如下： 氟利昂TF冷凍干燥法： 1. 固定脫水按常規(guī)方法進(jìn)行。 2. 置換 按圖中所示的比例配好氟利昂TF和酒精混合液,，并通過(guò)這些混合液將樣品逐步引入100％氟利昂TF,。 3. 冷凍 把樣品浸入液氮中冷凍。 4.干燥 將樣品放在預(yù)先冷卻的鋁座上,，再移入真空噴鍍儀中抽真空(約1Pa),，經(jīng)0～20min后即完全干燥。90min后鋁座變?yōu)槭覝?，即取出樣品、裝臺(tái),、鍍膜觀察,。 乙腈(acetonitrile)真空干燥法： 這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時(shí)會(huì)冷卻固化這一性質(zhì)，將樣品干燥的很獨(dú)特的方法,。其操作步驟如下： 1. 固定,、水洗按常規(guī)方法進(jìn)行。 2. 脫水 使用上升的系列乙腈(50％～100％)脫水各20min,。 3. 滲透 在容量約Iml的鋁制容器中裝滿(mǎn)乙腈,，并投入樣品。 4. 升華 把容器放入真空噴鍍儀中抽真空,，此時(shí)由于乙腈急速蒸發(fā)而使容器急劇冷卻,，其中乙腈也變成冰狀固體。然后繼續(xù)抽真空,，使乙腈升華,，約經(jīng)30min，樣品即達(dá)干燥,。 5. 待容器回升到室溫后,，即可取出樣品裝臺(tái)鍍膜進(jìn)行觀察。 據(jù)田中敬一報(bào)道此法干燥的效果與臨界點(diǎn)干燥沒(méi)有什么不同,。 茨烯干燥法 莰烯是一種樟腦類(lèi)無(wú)色結(jié)晶體,，能溶于醚、環(huán)乙烷,、環(huán)己烯和氯仿中,，室溫下呈固體狀，能在較低的溫度下升華,，從固態(tài)直接變成氣態(tài),，表面張力小,，故經(jīng)它干燥的樣品較松軟，變形小,，操作也較簡(jiǎn)便,。 莰烯干燥法是由Warrens．Buk于1971年提出的，其操作步驟如下： 1.取新鮮材料迅速投入0．1mol/L磷酸緩沖液中漂洗,，然后投入5％的戊二醛(用磷酸緩沖液配制的pH7.4)中固定1h,。 2.轉(zhuǎn)至加有5.4％蔗糖的0．1mol/L磷酸緩沖液中，在冷凍溫度下過(guò)夜,。 3.用l％的四氧化鋨(磷酸緩沖液配制)溶液中固定2h,。 4.用磷酸緩沖液或雙蒸水漂洗2～3次，每次,、15min,。 5.用30％，50％,，70％,，90％，95％和100％丙酮脫水,，每級(jí)15min,。 6.用100％的苯脫酯。 7.在1：1苯與環(huán)氧丙烷中浸泡15min,，再轉(zhuǎn)至純環(huán)氧丙烷中,，在45℃下經(jīng)20min后，轉(zhuǎn)入預(yù)先在水浴箱中加溫成液體的莰烯中浸透,，取出樣品裝臺(tái),。 8.放入真空干燥器中，在室溫下抽真空1h左右,，使莰烯直接從固體中升華,，然后鍍膜。 樣品的裝臺(tái)粘膠 將樣品裝固在樣品臺(tái)上,，最好采用導(dǎo)電膠,。常用的導(dǎo)電膠有兩種：一種是銀粉導(dǎo)電膠，這是一種將很細(xì)的銀粉拌在低電阻樹(shù)脂液內(nèi)制成的膠水,，使用較為方便,，這種樹(shù)脂的絕緣電阻低，干后的電阻率僅為0.02Ω／mm,，并可以被溶劑溶解還原,也有其它產(chǎn)品的銀粉導(dǎo)電膠,。另一種是將石墨粉拌在低電阻樹(shù)脂液內(nèi)的碳導(dǎo)電膠，它價(jià)格低廉,，效果也很好,。 對(duì)不鍍膜而直接觀察的樣品,，必須用導(dǎo)電膠來(lái)粘固，對(duì)于要鍍膜的樣品,，則可以用其他膠水(如萬(wàn)能膠,、乳膠等)來(lái)代替，微細(xì)的樣品(如粉末,、纖維)也可用雙面膠紙來(lái)粘貼,。 樣品底面面積較小的樣品(如圓形)，裝臺(tái)粘膠時(shí),，不能像圖10-3(a)那樣,，膠水僅涂樣品與樣品臺(tái)接觸的那一小部分，這樣不僅樣品不易裝固,，而且鍍膜時(shí)產(chǎn)生死角,，金屬膜層與樣品臺(tái)不相接，導(dǎo)性電能差,，易產(chǎn)生充電現(xiàn)象,，從而影響觀察和拍照。因此,，應(yīng)多涂點(diǎn)膠，像圖10-3(b)那樣,，這樣就能保證鍍層在最薄的情況下也能與樣品臺(tái)形成連續(xù)的導(dǎo)電膜,，同時(shí)也使樣品粘得牢；樣品粘好后應(yīng)待膠水層內(nèi)外都干透后才進(jìn)行鍍膜和觀察,，否則會(huì)影響鍍膜效果和污染電鏡鏡筒,，尤其是光欄。 對(duì)于大塊的多角形的厚樣品,，裝臺(tái)時(shí),，膠水也應(yīng)涂成斜面。對(duì)纖維類(lèi)樣品,，可以像牙刷那樣穿在鉆有孔的樣品臺(tái)上,，齊根處涂以膠水加固(觀察橫切面時(shí))或平粘于樣品臺(tái)上，兩端用膠水固定(觀察纖維表面時(shí)),。 對(duì)于微粒,、粉末類(lèi)樣品粘膠時(shí)應(yīng)盡量避免成團(tuán)，以利于尋找典型圖樣和提高鍍膜效果,，對(duì)于此類(lèi)樣品,，可制成稀的懸浮液，然后滴在樣品臺(tái)上,，或在樣品臺(tái)上粘上雙面膠紙后,，用牙簽纏上棉花蘸取粉末樣品,，再用吹氣球?qū)悠份p輕吹落在樣品臺(tái)上，效果也較好,。 總之不論是那類(lèi)樣品,，都應(yīng)達(dá)到粘膠牢固，便于鍍膜和圖像背景美觀清晰的要求,。
