掃描電鏡生物樣品的制樣技術(shù)
大多數(shù)生物樣品都含有水分,，而且比較柔軟，因此,，在進(jìn)行掃描電鏡觀察前,，要對樣品作相應(yīng)的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是：盡可能使樣品的表面結(jié)構(gòu)保存好,，沒有變形和污染,，樣品干燥并且有良好導(dǎo)電性能。 一．樣品的初步處理 (一) 取材 樣品面積可為8mm×8mm,，厚度可為5mm,。對于易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等,，可固定在濾紙或卡片紙上,，以充分暴露待觀察的組織表面,。 (二) 樣品的清洗 用掃描電鏡觀察的部位常常是樣品的表面，即組織的游離面,。由于樣品取自活體組織,，其表面常有血液、組織液或粘液附著,，這會(huì)遮蓋樣品的表面結(jié)構(gòu),，影響觀察。因此,，在樣品固定之前,，要將這些附著物清洗干凈。清洗的方法有以下幾種： 1．用等滲的生理鹽水或緩沖液清洗,； 2．用5%的蘇打水清洗,； 3．用超聲震蕩或酶消化的方法進(jìn)行處理。例如清洗腸粘膜表面的粘液,，可用下面的方法： 清洗液配方：透明質(zhì)酸酶 300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理鹽水 100 ml清洗液的pH為5.5～6,。 清洗的方法是將樣品浸泡在配好的清洗液中，邊浸泡邊震蕩30分鐘,，最后用雙蒸水洗3次,。無論用哪種清洗方法，注意在清洗時(shí)不要損傷樣品,。 (三) 固定 固定樣品的常用試劑為戊二醛及鋨酸雙固定,。由于樣品體積較大，固定時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長,。也可用快速冷凍固定,。 (四) 脫水 樣品經(jīng)漂洗后用逐級增高濃度的酒精或丙酮脫水，然后進(jìn)入中間液,，一般用醋酸異戊酯作中間液,。 二．樣品的干燥 掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進(jìn)行。無論是水或脫水溶液,，在高真空中都會(huì)產(chǎn)生劇烈地汽化,，不僅影響真空度、污染樣品,，還會(huì)破壞樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu),。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進(jìn)行干燥,。干燥的方法有以下幾種： (一) 空氣干燥法 空氣干燥法又稱自然干燥法,，就是將經(jīng)過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥,。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡便易行和節(jié)省時(shí)間,；它的主要缺點(diǎn)是在干燥過程中,，組織會(huì)由于脫水劑揮發(fā)時(shí)表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此,，該方法一般只適用于表面較為堅(jiān)硬的樣品,。 (二) 臨界點(diǎn)干燥法 臨界點(diǎn)干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時(shí)，其表面張力等于零的特性,，使樣品的液體完全汽化,，并以氣體方式排掉，來達(dá)到完全干燥的目的,。這樣就可以避免表面張力的影響,，較好地保存樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。此法操作較為方便,，所用的時(shí)間也不算長,，一般約2～3小時(shí)即可完成，所以是最為常用的干燥方法,。但用此法,，需要特殊儀器設(shè)備。臨界點(diǎn)干燥是在臨界點(diǎn)干燥儀中進(jìn)行的,，操作步驟如下： 1．固定,、脫水：按常規(guī)方法進(jìn)行。如樣品是用乙醇脫水的,，在脫水至100%后,，要用純丙酮置換15～20分鐘。 2．轉(zhuǎn)入中間液：由純丙酮轉(zhuǎn)入中間液醋酸異戊酯中,，時(shí)間約15～30分鐘,。 3．移至樣品室：將樣品從醋酸異戊酯中取出，放入樣品盒,，然后移至臨界點(diǎn)干燥儀的樣品室內(nèi),，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。 4．用液體二氧化碳置換醋酸異戊酯：在達(dá)到臨界狀態(tài)(31(C , 72.8大氣壓)后,，將溫度再升高10(C,，使液體二氧化碳?xì)饣缓蟠蜷_放氣閥門,，逐漸排出氣體,，樣品即完全干燥。 (三) 冷凍干燥法 冷凍干燥法是將經(jīng)過冷凍的樣品置于高真空中,，通過升華除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冷凍干燥的基礎(chǔ)是冰從樣品中升華,，即水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài),，不經(jīng)過中間的液態(tài),，不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用，從而減輕在干燥過程中對樣品的損傷,。冷凍干燥法有兩種,，即含水樣品直接冷凍干燥和樣品脫水后冷凍干燥。 1．含水樣品直接冷凍干燥法 1.1 取材固定：按常規(guī)方法進(jìn)行,。 1.2 置于冷凍保護(hù)劑中：將樣品置于冷凍保護(hù)劑中浸泡數(shù)小時(shí),。常用的冷凍保護(hù)劑為10%～20%二甲基亞砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液,。 1.3 驟冷：將經(jīng)過保護(hù)劑處理的樣品迅速投入用液氮預(yù)冷至(150(C的氟利昂冷凍劑中,，使樣品中的水分很快凍結(jié)。 1.4 干燥：將已凍結(jié)的樣品移到冷凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣品臺上,，抽真空,，經(jīng)幾小時(shí)或數(shù)天后，樣品即達(dá)到干燥,。 本方法不需要脫水,，避免了有機(jī)溶劑對樣品成分的抽提作用，不會(huì)使樣品收縮,，也是較早使用的方法,。但是，由于花費(fèi)時(shí)間長,，消耗液氮多,，容易產(chǎn)生冰晶損傷，因此未被廣泛應(yīng)用,。 2．樣品脫水后冷凍干燥 樣品用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中,，然后連同這些溶劑一起冷凍并在真空中升華而達(dá)到干燥。和前一種方法比較,，本方法的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)產(chǎn)生冰晶損傷,，且干燥時(shí)間短。不足之處是有機(jī)溶劑對樣品成分有抽提作用,，造成部分內(nèi)含物丟失,。 乙腈(acetonitrile)真空干燥法：這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時(shí)會(huì)冷卻固化的性質(zhì)將樣品干燥的方法。其操作步驟如下： (1) 固定,、水洗：按常規(guī)方法進(jìn)行,。 (2) 乙腈置換：分別使用50%、70%,、80%,、90%的乙腈水溶液置換，最后用100%乙腈代替，每步驟15～20分鐘,。 (3) 干燥：至純乙腈時(shí),，放入真空鍍膜臺抽真空，乙腈和樣品在真空中很快致冷而被凍結(jié)(凍結(jié)的溫度為(45(C),，變成冰狀固體,。然后繼續(xù)抽真空，使凍結(jié)的乙腈升華,，約需30分鐘,，樣品即達(dá)干燥。 樣品干燥后要粘在樣品臺上,。對于不鍍膜而直接觀察的樣品,，必須用導(dǎo)電膠來粘固；對于要鍍膜的樣品,，則可以用膠水或萬能膠來代替,，微細(xì)的樣品如粉末、纖維等也可用雙面膠紙來粘貼,。 三．樣品的導(dǎo)電處理 生物樣品經(jīng)過脫水,、干燥處理后，其表面不帶電,，導(dǎo)電性能也差,。用掃描電鏡觀察時(shí)，當(dāng)入射電子束打到樣品上,，會(huì)在樣品表面產(chǎn)生電荷的積累,，形成充電和放電效應(yīng)，影響對圖象的觀察和拍照記錄,。因此在觀察之前要進(jìn)行導(dǎo)電處理,，使樣品表面導(dǎo)電。常用的導(dǎo)電方法有以下幾種： (一) 金屬鍍膜法 金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬,，如金,、鉑、鈀等蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面的方法,。樣品鍍以金屬膜后,，不僅可以防止充電、放電效應(yīng),，還可以減少電子束對樣品的損傷作用,，增加二次電子的產(chǎn)生率，獲得良好的圖象,。 1．真空鍍膜法 真空鍍膜法是利用真空鍍膜儀進(jìn)行的,。其原理是在高真空狀態(tài)下把所要噴鍍的金屬加熱,，當(dāng)加熱到熔點(diǎn)以上時(shí)，會(huì)蒸發(fā)成極細(xì)小的顆粒噴射到樣品上,，在樣品表面形成一層金屬膜,，使樣品導(dǎo)電。噴鍍用的金屬材料應(yīng)選擇熔點(diǎn)低,、化學(xué)性能穩(wěn)定、在高溫下和鎢不起作用以及有高的二次電子產(chǎn)生率,、膜本身沒有結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在一般選用金或金和碳。為了獲得細(xì)的顆粒,，有用鉑或用金—鈀,、鉑—鈀合金的。金屬膜的厚度一般為10nm～20nm,。真空鍍膜法所形成的膜,，金屬顆粒較粗，膜不夠均勻,，操作較復(fù)雜并且費(fèi)時(shí),，目前已經(jīng)較少使用。 2．離子濺射鍍膜法 在低真空(0.1～0.01乇)狀態(tài)下,，在陽極與陰極兩個(gè)電極之間加上幾百至上千伏的直流電壓時(shí),，電極之間會(huì)產(chǎn)生輝光放電。在放電的過程中,，氣體分子被電離成帶正電的陽離子和帶負(fù)電的電子,，并在電場的作用下，陽離子被加速跑向陰極,，而電子被加速跑向陽極,。如果陰極用金屬作為電極(常稱靶極)，那么在陽離子沖擊其表面時(shí),，就會(huì)將其表面的金屬粒子打出,，這種現(xiàn)象稱為濺射。此時(shí)被濺射的金屬粒子是中性,，即不受電場的作用,，而靠重力作用下落。如果將樣品置于下面,，被濺射的金屬粒子就會(huì)落到樣品表面,，形成一層金屬膜，用這種方法給樣品表面鍍膜,，稱為離子濺射鍍膜法,。 和真空鍍膜法比較，離子濺射鍍膜法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)由于從陰極上飛濺出來的金屬粒子的方向是不一致的，因而金屬粒子能夠進(jìn)入到樣品表面的縫隙和凹陷處,，使樣品表面均勻地鍍上一層金屬膜,，對于表面凹凸不平的樣品，也能形成很好的金屬膜,，且顆粒較細(xì),。(2)受輻射熱影響較小，對樣品的損傷小,。(3)消耗金屬少,。(4)所需真空度低，節(jié)省時(shí)間,。） (二) 組織導(dǎo)電法 用金屬鍍膜法使樣品表面導(dǎo)電,，需要特殊的設(shè)備，操作比較復(fù)雜,，同時(shí)對樣品有一定程度的損傷,。為了克服這些不足，有人采用組織導(dǎo)電法(又稱導(dǎo)電染色法),，即利用某些金屬 溶液對生物樣品中的蛋白質(zhì)?脂類和醣類等成分的結(jié)合作用,，使樣品表面離子化或產(chǎn)生導(dǎo)電性能好的金屬鹽類化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導(dǎo)電率,。此法的基本處理過程是將經(jīng)過固定,、清洗的樣品，用特殊的試劑處理后即可觀察,。由于不經(jīng)過金屬鍍膜,，所以不僅能節(jié)省時(shí)間，而且可以提高分辨率,，還具有堅(jiān)韌組織,，加強(qiáng)固定效果的作用。組織導(dǎo)電法主要有碘化鉀導(dǎo)電染色法,、碘化鉀--醋酸鉛導(dǎo)電法,、丹寧酸—鋨酸導(dǎo)電法等。比較常用的是丹寧酸—鋨酸導(dǎo)電法,，其具體操作方法如下： (1)樣品處理：按常規(guī)方法取材,、清洗及用戊二醛固定。 (2)導(dǎo)電染色：將樣品放入2%～4%丹寧酸溶液中浸泡,。如果觀察表面結(jié)構(gòu),，浸泡時(shí)間為30分鐘；如果觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu),，浸泡時(shí)間為8小時(shí),，即可過夜,。在浸泡過程中，可更換一次溶液,。 (3)清洗及再固定：用磷酸緩沖液充分清洗,，然后放入1%鋨酸中固定2～4小時(shí)，再用磷酸緩沖液清洗,。 (4)脫水和干燥：按常規(guī)方法,。 (5)掃描電鏡觀察
